在过去的几十年里，有机小分子催化剂凭借操作简单、易于获取、价格低廉和环境友好等优势已成为不对称合成研究的热点。2021年，诺贝尔化学奖授予BenjaminList和，以表彰他们在“不对称有机催化发展”中做出的卓越贡献。受小分子催化的启发，生物催化研究者开始重新利用天然黄素、烟酰胺依赖性酶和金属酶来催化非天然反应，特别是立体选择性自由基介导的转化。鉴于非天然氨基酸（ncAAs）广泛存在于生物活性天然产物、肽类药物和功能性非天然蛋白质中，如何高效立体选择性地构建ncAAs已成为合成化学和合成生物学的主要目标。目前，ncAAs的传统化学合成法依赖于繁琐的氨基和羧酸保护基团的安装和去除。相比之下，吡哆醛5′-磷酸（PLP）酶能以优异的化学选择性和立体选择性构建和降解游离氨基酸，因此可作为ncAA合成的生物催化剂并且无需保护基操作。作为一种成员众多的酶家族，PLP依赖性酶具有多样化的结构和功能，并且能通过羰基催化机制催化氨基酸α、β和γ位的C-C和C-杂原子成键反应（图1A）。如果能将酶和小分子催化剂实现的两种不同催化循环相结合，那么就能实现传统酶学和合成化学先前无法实现的活化模式。
首先，作者选择苄基三氟硼酸盐1a为模板底物对反应条件进行筛选，并得到最佳反应条件：即1a在L-PfPLPβ为生物催化剂（1.0mol%）、罗丹明B（RhB，10mol%）为光催化剂于微酸性条件下（pH=6.0）进行反应时，能以73%的产率和93:7值获得C-C键偶联产物L-3a。对照实验表明酶催化剂L-PfPLPβ、光氧化还原催化剂RhB和光源缺一不可，进而说明该反应是双催化过程。当用5mol%的游离PLP辅因子替代酶催化剂进行反应时却没有获得产物，这凸显了PLP辅因子和蛋白质骨架之间的协同作用。值得一提的是，该生物催化剂能够选择性地将外消旋(D/L)-丝氨酸[(rac)-2a]转化为单一的异构体L-3a并且具有相同的产率和值。此外，将水性缓冲液的pH值从6.0增加至8.0后，反应的对映选择性会逐步降低，并且在的条件下获得了外消旋产物3a（49:51）。其次，作者还测试了一个小的PLP酶变体库，发现L-PfPLPβ的单突变体E104G（即D-PfPLPβ）逆转了对映选择性（图2B），以79%的产率和6:94值生成D-高苯丙氨酸D-3a。类似地，D-PfPLPβ也能选择性地将过量的(D/L)-丝氨酸[(rac)-2a]以相同的产率和对映选择性转化为D-3a。有趣的是，D-PfPLPβ的生物催化对培养基的pH值不敏感，并且在较高pH值下对映选择性有所增加。
在最优条件下，作者对该反应的底物范围进行了探索（图3），结果显示L-PfPLPβ和D-PfPLPβ均可有效促进多种三氟硼酸盐底物的转化，包括：芳环上对位（3b）、间位（3c）和邻位（3d）甲基、间位（3e）和对位（3j）甲氧基、间位氟原子（3f）、氯原子（3g）、酯基（3h）、氰基（3i）取代的苄基三氟硼酸盐、大位阻双环底物（3k、3l）以及烷基三氟硼酸盐底物（3m-3o），尽管烷基三氟硼酸盐底物产率低。此外，D-PfPLPβ催化3m进行反应时生成的主要对映体是L-3m。值得一提的是，L-PfPLPβ催化反应时para-(L-3b)要比meta-(L-3c)和ortho-(L-3d)取代的底物具有更高的对映选择性；而使用D-PfPLPβ催化反应时，三种底物的对映选择性相当（D-3b至D-3d）。
该双催化策略能以优异的非对映选择性和对映选择性构建颇具挑战性的连续立体中心化合物，无需进一步的定向进化。如图4A所示，L-PfPLPβ能够有效催化苏氨酸（2b）和多种苄基三氟硼酸盐的反应，并以优异的产率和立体选择性获得具有相邻α和β立体中心的异亮氨酸衍生物（4a-4e）。此外，外消旋仲烷基自由基前体[(rac)-1p]也能兼容该反应，以优异的产率、非对映选择性和对映选择生成具有三个相邻立体中心的产物5a（图4B）。值得一提的是，回收的底物1p在不同转化率下的值为50:50，这表明该过程不涉及(rac)-1p的动力学拆分，进而证实了该过程的对映汇聚式转化。最后，作者还通过N-酰化产物6a、6b和6c的X-射线单晶衍射分析确定了C-C键偶联产物3a、4a和5a的相对立体化学和绝对立体化学（图4C）。
为了进一步探究反应机理，作者进行了自由基捕获实验，在标准条件下以14%的产率获得TEMPO捕获自由基产物，同时模型反应（1a+2a→L-3a）的GC-MS分析获得了苄基自由基衍生的副产物（如：二苄基（~1%）和PhCHO（~5%）），这些结果证实了反应过程中苄基自由基的生成。其次，作者还进行了密度泛函理论（DFT）计算（图5A），结果表明内部醛亚胺与外部醛亚胺7之间的转化需要低活化能垒。从外部醛亚胺7出发，通过赖氨酸残基K82（TS-1）进行α-位去质子化并形成中间体8，后者在酸性天冬氨酸残基D300的作用下进行β-羟基消除并形成关键的氨基丙烯酸酯物种10（活化能垒为17.0kcal/mol）。随后，光氧化还原催化产生的苄基自由基9通过TS-3加成到10的β碳上并产生azaallyl自由基中间体11。由于11中未成对电子大部分位于氨基酸的Cα原子上，因此其经历ET/PT产生外部醛亚胺13。此外，Marcus理论计算表明11与还原型光催化剂[RhB]•−之间的ET（可能是通过远程ET）在动力学和热力学上都是可行的，随后的PT步骤（TS-4）能垒相对较低（16.0kcal/mol）。如图5B、5C所示，过渡态计算表明蛋白质骨架在控制苄基自由基9与氨基丙烯酸酯10加成的区域选择性方面具有关键作用，这是因为自由基加成到β位（C1）要比C2位的能垒低（ΔΔH‡=3.2kcal/mol）。在没有任何活性位点残基的情况下，自由基加成到游离PLP辅因子时几乎没有选择性，这是因为电子效应倾向于更缺电子且具有更大LUMO系数的C2位，而空间效应则倾向于β位（C1）。尽管由于芳香性的破坏导致吡啶环C3位的加成（TS3′′）在动力学上不利，但氨基丙烯酸酯中间体（10）的β位（C1，TS3）和吡哆醛碳（C2，TS3′）的自由基加成具有相当的活化能垒。
总结
本文作者利用光氧化还原催化和吡哆醛5'-磷酸（PLP）生物催化的协同催化策略，开发了一种吡哆醛自由基生物催化方法来制备有价值的非天然氨基酸，无需保护基团即可构建具有两个或者三个立体中心的非天然氨基酸。值得一提的是，通过酶工程还可以获得L-氨基酸和D-氨基酸。毫无疑问，这种协同催化策略为发现前所未知的反应和研究不对称催化自由基中间体提供了一种新的思路。
Stereoselectiveaminoacidsynthesisbysynergisticphotoredox-pyridoxalradicalbiocatalysis
LeiCheng,DianLi,BinhKhanhMai,ZhiyuBo,LidaCheng,PengLiu,YangYang
Science,2023,381,444-451,DOI:10.1126/
（本文由吡哆醛供稿）
